在《生化危机终5》中，保护人类的政府组织BSAA营救了一名被绑架的女孩，并跟踪到尼罗河生物危机的源头，发现了邪恶组织TriCell将卡拉吸血鬼毒株注射到试验动物身上，导致恐怖生物大量冒出。

同时，Ada秘密出现，在和女主角克蕾儿的对决中，揭露了恶势力的阴谋，最终让克蕾儿叛投对方。

最后，主角克里斯与秘密伙伴乔什击败了巨大的人造武器，挫败了TriCell计划，守护了人类的平安。

该片主要讲述了爱丽丝与救援小队合力从伞公司的海底设施逃出，并与威斯克汇合，准备进行最终决战的故事。

《生化危机5》故事发生在一个非洲的无名小国中（假想）。这个国家地处延绵厄立特里亚（Eritrea）,埃塞俄比亚（Ethiopia）以及肯尼亚（Kenya）三国的活火山带上。游戏开始时，当地的居民并没有受到感染，但是随着火山活动的爆发，病毒逐渐传播并将当地的居民变成了类似于丧尸的杀人生物。《生化危机5》（Resident Evil 5）的故事背景被设定在非洲大陆，男主角是老“生化迷”所熟知的克里斯，也就是《生化危机》首作的男主角。 本作与前几作不同，由于光与暗一直以来都是《生化危机》系列所贯彻的抽象理念，所以制作方希望在这次的作品中创造更加逼真的光影效果，并将之与游戏的这一理念进行融合。

制作方一直强调的利用肉眼对光的适应力来营造恐怖气氛的手法，也正是该理念的一个组成部分。《生化危机5》将抛弃过去以黑暗为风格，而强调一种“阳光下的恐怖感”，再加上，制作人竹内润认为本将希望能展示病毒的起原，所以便将非洲列为了游戏的背景舞台。

《生化危机5》以延续一切故事开端的《生化危机》洋房危机10年后为背景，故事舞台搬到了人类发源地非洲，在这块炎热的大地上拥有并非僵尸也不属于寄生兽的敌人，饱经历练的克里斯（Chris）将与新搭档谢娃（Sheva）共同面对潜藏于黑暗大陆的神秘生化危机。

登场敌人部分，除了有玩家所熟悉的生化僵尸犬，貌似巨型蝙蝠的全新登场生化合成怪兽，以及受到寄生而失去理智成为嗜血杀人狂的电锯人、巨斧刽子手等也都将一一登场。